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则4℃ 离心10 000r/min

RNA是基因表达的中间产品,存在于细胞质与核中。对RNA举办操纵在分子生物学中占有重要职位。得到高纯度和完整的RNA 是许多分子生物学尝试所必须的,如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等尝试的成败,在很洪流平上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部门RNA是以核卵白复合体的形式存在,所以在提取RNA时要操作高浓度的卵白质变性剂,迅速粉碎细胞布局,使核卵白与RNA疏散,释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理惩罚、离心,使RNA与其他细胞组分疏散,获得纯化的总RNA。在提取的进程中要抑制内源和外源的RNase活性,掩护RNA分子不被降解。因此提取必需在无RNase的情况中举办。可利用RNase抑制剂,如DEPC是RNase的强抑制剂,常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等卵白质变性剂,纯化蛋白磁珠,也能抑制RNase活性。并有助于撤除非核酸身分。

本尝试先容异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳举办判断。

二、仪器和试剂

1.仪器:

超净事情台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h;不耐高温的器皿(如塑料成品)应用0.1% DEPC浸泡2h,70~80℃ 烘烤干燥,120℃高压20min,六孔磁力架,再70~80℃烘烤干燥方可利用。

2.试剂:

(1)细胞裂解液:

异硫氰酸胍 4mol/L

柠檬酸钠(pH7.0) 25mmol/L

十二烷基肌氨酸钠 0.5%

β-巯基乙醇 0.1mol/L

称取柠檬酸钠0.64g,十二烷基肌氨酸钠0.415g,吸取β-巯基乙醇0.7ml,用无Rnase的蒸馏水溶解,定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml,异硫氰酸胍 25g,混淆,完全溶解后4℃生存备用。

(2)10×凝胶缓冲液:

吗啉代丙璜酸(MOPS)(pH7.0) 200mmol/L

NaAc 100mmol/L

EDTA(pH 8.0) 10mmol/L

过滤除菌后避光生存。

(3)5×变性上样缓冲液:

水饱和的溴酚蓝 16μl

500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl

甲醛(37%) 720μl

甘油 2ml

甲酰胺 3084μl

10×凝胶缓冲液 4ml

加无RNase水至10ml,4℃可生存3个月。

(4)TRIzol RNA抽提试剂

(5)2mol醋酸钠

(6)0.1% DEPC

(7)均衡酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

(8)均衡酚、氯仿

(9)无水乙醇、70%乙醇、异丙醇

(10)无RNase水

三、操纵步调

(一)异硫氰酸胍法(PLT)

1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于组织匀浆器中,插手预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15~30s,以充实研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2.插手2mol醋酸钠(pH4.0)120μl,充实混匀。

3.插手1.2ml酚:氯仿:异戊醇,充实混匀摇振10s,金属脱模剂,冰浴15min。

4.将混淆物转移至1.5ml Ep管中,4℃,离心10 000r/min,20min.

5.移取上层水相至另一Ep管中,插手等体积的异丙醇,荧光定量PCR发泡水泥,静置?C20℃,30min沉淀RNA.

6. 4℃,离心12 000r/min,氨基磁珠,15min.

7. 弃上清液,插手70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物;假如RNA沉淀物被悬浮,则4℃ 离心10 000r/min,10min。

8. 弃上清液,自然干燥,但应制止沉淀完全干燥,不然RNA难以溶解。

9.插手100μl无RNase水重悬RNA,或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠(pH4.0),?C70℃生存。

(二)TRIzol试剂提取RNA

1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于组织匀浆器中,插手预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中,DNA试剂盒,在冰浴中迅速匀浆15~30s,以充实研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中,于室温下静置5min。

2.插手200μl氯仿,猛烈振摇15s混匀后,室温静置3min。

3. 4℃,10 000r/min离心15min,RNA漫衍于水相中。

4.将上层无色水相转移到另一Ep管中,插手500μl 异丙醇,室温静置10min。

5.4℃,10 000r/min离心10min。

6.弃上清液,用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物,4℃,7500r/min离心5min。

7.弃上清液,室温干燥15min.

8.向干燥过的沉淀物中插手200μl DEPC处理惩罚水(无核水)溶解沉淀物,于-20℃生存备用。

(三)RNA检测

1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。

要领同尝试四,用DEPC处理惩罚水校正零点;用DEPC处理惩罚水稀释RNA样品;读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

(1)制备凝胶(1.2%)。称1.2g琼脂糖,加72ml DEPC处理惩罚水,加热熔化。冷却至60℃,在通风橱内插手10×凝胶缓冲液10ml,酶联免疫磁珠,甲醛(37%)18ml,混匀后,倒胶。

(2)制备样品。在离心管中,将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4:1混匀。65℃温育5~10min,迅速在冰上冷却5min,离心数秒。

(3)上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳1.5~2h.。

(4)待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处竣事电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液(0.5μg/ml,用0.1mol/L乙酸胺配制)中染色约30min。

(5)在凝胶成像系统调查并阐明。

四、留意事项

1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必需在无RNase 情况中,戴口罩、手套、利用无RNase污染的试剂、质料、容器。

2.所有溶液应加DEPC至0.05%~0.1%,室温处理惩罚留宿,然后高压处理惩罚或加热至70℃ 1 小时或60℃留宿,以撤除石油残留的DEPC。

3.所用的化学试剂应为新包装,称量时利用干烤处理惩罚的称量勺,所有操纵均应在冰浴中举办,包被生物磁珠,低温条件可减低RNA酶活性。

4.按照RNA样品的紫外接收OD值,可计较出RNAd 浓度。

单链RNA [ssRNA]=40×(OD260-OD310)×稀释倍数

纯RNA OD260 / OD280比值凡是在1.7~2.0。若比值低于1.7,说明有卵白质等污染,应用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表白有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以撤除杂质。

5.RNA样品电泳后,可见28S、18S及5S小分子RNA条带,细菌DNA提取试剂盒,则说明完整性好。若有降解大概是操纵不妥或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2:1,表白RNA无降解。如比值逆转,则表白RNA降解。电泳中假如在28S 后方尚有条带,表白有DNA污染,应用DNase处理惩罚后再举办纯化。

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