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RNA甲醛变性凝胶电泳和转膜

组织细胞中提取出来的核酸(DNA/RNA)经琼脂糖凝胶电泳将其按分子量的巨细疏散,然后将其转移到固相支持物上(如:硝酸纤维素膜),用被标志的已知核酸片段(探针)对固相支持物上的待检测核酸举办检测(杂交)。
一、RNA电泳甲醛变性电泳)
【目标】 将DNA/RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中疏散出来,通过插手尺度核酸分子(markers)对其举办判断,并用于转膜、杂交等。

【试剂】
10×MOPS缓冲液:
0.2mol/L MOPS(3-〔N-吗啉〕丙磺酸)
80mmol/L NaAc
10mmol/L EDTANa2
先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS4.1gNaAc后,插手10ml 0.5mol/L EDTA,定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌,法医样本DNA提取试剂盒,避光生存。
1×MOPS电泳缓冲液:
10×MOPS 150ml
37%甲醛 80ml
加水至1500ml。
甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液(10×):
50%甘油
1mmol/L EDTA
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
5ml甘油、20ml 0.5mol/L EDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯青FF,加DEPC水至10ml,高压后,4°C生存。
5mol/L EDTA(pH8.0)
37%甲醛、甲酰胺等。

【操纵步调】
1. 电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min,DEPC水冲洗晾干。
2. 铺胶(20ml)
琼脂糖 0.24g (1.2%)
无RNase水 17.4ml
10×MOPS 2.0ml
37%甲醛 0.6ml
EB 1ml
将琼脂糖加水融化后,加10×MOPS,待胶冷却至60°C阁下,再加甲醛EB。(若铺大胶可将上述各试剂的量加大2倍)。
3. RNA样品处理惩罚(以一条泳道为例)

4.加2.0ml甲醛凝胶加样缓冲液(10×)
5.加样和电泳
将凝胶预电泳5min,电压降为5v/cm。随后加样品和尺度物,以3-4v/cm电压降电泳,电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处。
6. 电泳竣事后,发泡水泥稳泡剂,在紫外灯下,,仔细丈量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的间隔,DNA提取试剂盒,并同荧光尺一起照相,以记录尺度物的位置。

【留意事项】
1. 每一泳道至多可阐明30mg RNA,凡是用10-20mg总RNA举办Northern杂交,可以检测高品貌mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA含量极微,每个泳道加0.5-3.0mg poly(A)+ RNA。
2. 尺度物28S rRNA»6333 base;18S rRNA»2366 base;9S兔b珠卵白mRNA»710 base。 溴酚蓝在前(»300bp),二甲苯青FF在后(»4kb)。

二、RNA样品的转膜(虹吸印迹法)

【试剂】
20×SSC:175.3g NaCl,发泡水泥,88.2g柠檬酸钠,DEPC水定容1000ml
NaOH调pH至7.0,高压后备用。
6×SSC: 用20×SSC稀释。

【操纵步调】
1. 将电泳后的凝胶用蒸流水漂洗2min,20×SSC浸泡30min。
2.剪一与凝胶巨细相等的硝酸纤维素膜,磁力架,用蒸流水浸湿后放入20×SSC中。
3.在方盘上安排一平板,其上安排一滤纸,滤纸两头搭入盘内浸入20×SSC中。
4.将凝胶倒置于平台上, 底面朝上,发泡水泥,切掉右下角,免疫磁珠,并用保鲜膜关闭附近。
5.将硝酸纤维素膜放于胶上,赶走气泡。
6.膜上放两张滤纸,其上再放20层吸水纸。
7.吸水纸上放一平板,其上放500g阁下的重物。
8.室温下留宿转膜,期间换纸2-3次。
9.完成转膜后,在紫外灯下调查结果,并标志好序号、加样孔位置和28S,磁性微球,18S的位置。
10.用6×SSC浸泡硝酸纤维素膜5分钟,自保温砌块,滤纸吸干,80°C烤箱真空干燥2小时。室温生存。

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