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DA测定胞内ROS配景高(荧光,活性氧,荧光标志,含量)

作者:互联网 发布时间:2017-06-19

DCFH-DA测定胞内ROS配景高(荧光,活性氧,荧光标志,含量) DCFH-DA测定胞内ROS配景高(荧光,活性氧,荧光标志,含量)

标题: DCFH-DA测定胞内ROS配景高(荧光,活性氧,荧光标志,含量)
摘要: [DCFH-DA测定胞内ROS配景高(荧光,活性氧,荧光标志,含量)] 如题,最近在利用DCFH-DA荧光标志细胞内活性氧ROS的含量,利用的是碧云天的试剂盒,配有ROS的刺激尺度物ROSup。我凭听说明书操纵,96孔板养细胞24小时后,吸取造就液,加50微升10uM的DCFH-DA,37度抚养15min,之后取出,PBS洗3遍,加1mg L的ROSup,15min后调查荧光(蓝光引发,发的光为绿色)。我呈现的问题是:加了ROSup刺激后的细胞荧光和只加了DCFH-D 要害词:[荧光 荧光标志 活性氧 含量 造就液 试剂盒]……
要害词:

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如题,最近在利用DCFH-DA荧光标志细胞内活性氧ROS的含量,利用的是碧云天的试剂盒,配有ROS的刺激尺度物ROSup。
我凭听说明书操纵,96孔板养细胞24小时后,吸取造就液,加50微升10uM的DCFH-DA,37度抚养15min,之后取出,PBS洗3遍,加1mg/L的ROSup,15min后调查荧光(蓝光引发,发的光为绿色)。
我呈现的问题是:加了ROSup刺激后的细胞荧光和只加了DCFH-DA 的细胞都有荧光,可是都很弱,甚至刺激组比比较还弱,怎么回事啊?求助列位大侠~~~~

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(1)测定ROS完全可以不消试剂盒。直接从sigma购置DCFDA后返来溶解就行。

(2)你纵然利用试剂盒,出格是中国的试剂盒,也需要举办条件探索。我的履历是DCFDA的浓度要加到50uM才有荧光。你的浓度大概太低了。

(3)我测定ROS时基础没有用什么ROS up,测得也很好。

(4)你的DCFDA利用什么溶解的?我一般用无血清的造就基。

(5)加DCFDA之后需要避光孵育。

(6)你的药物刺激时间也需要探索,因此在初次尝试时需要配置阳性比较。

回覆


(1)测定ROS完全可以不消试剂盒。直接从sigma购置DCFDA后返来溶解就行。

(2)你纵然利用试剂盒,出格是中国的试剂盒,也需要举办条件探索。我的履历是DCFDA的浓度要加到50uM才有荧光。你的浓度大概太低了。

(3)我测定ROS时基础没有用什么ROS up,测得也很好。

(4)你的DCFDA利用什么溶解的?我一般用无血清的造就基。

(5)加DCFDA之后需要避光孵育。

(6)你的药物刺激时间也需要探索,因此在初次尝试时需要配置阳性比较。


感谢你的存眷!
1,利用试剂盒只是因为直接从sigma购置,量太多我用不了,价格也贵~试剂盒里对象都是一样的;
2,大概是我DCFH-DA用量不足。期间我还用过24孔板,加DCFH-DA的量为10uM的300ul,可是空缺和阳性比较同样有荧光,并且都很强。
3,我谁人Rosup其实就是做阳性比较的,装载探针后加Rosup,引发细胞内活性氧的增加,不是什么添加剂;
4,我用pbs稀释的,不知道这两种操纵有无不同~
5,避光的话需要到什么水平?拿铝箔把整个96孔板都遮住吗?

附图为我24孔板的阳性比较,即加了rosup刺引发糊口性氧的细胞荧光。
后一个是空缺,即只插手了DCFH-DA作为空缺比较的,没调好焦距,不外可以看出荧光也很强

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这一个是空缺,即只插手了DCFH-DA作为空缺比较的,没调好焦距,不外可以看出荧光也很强


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(1)我以为你的检测不能只通过眼睛调查荧光的强度。你必需要用荧光仪测定荧光接收强度,做量化检测。

(2)别的,假如你的细胞是可以消化的话,最好回收流式检测,功效是最精确的。

(3)荧光照片只能作为support evidence。并不重要。

回覆


(1)我以为你的检测不能只通过眼睛调查荧光的强度。你必需要用荧光仪测定荧光接收强度,做量化检测。

(2)别的,假如你的细胞是可以消化的话,最好回收流式检测,功效是最精确的。

(3)荧光照片只能作为support evidence。并不重要。


大白了~看来尚有许多几何要做的涅~贫苦...
ps:我们是化学尝试室,木有流式...

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厥后你们怎么办理了?我们也遇到雷同环境。我们是用流式检测,凭听说明书操纵,只加DCFH-DA的空缺比较比阳性比较的荧光还要强。

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各人看看我做的图片吧!我的DCFH-DA浓度加到20uM,孵育20分钟,可是荧光强度很低,不知道怎么回事?各人给点发起

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请问ROSUP在装探针之前照旧之后加呢?

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我们尝试室作的较量多,一般用流氏和cofocal检测。关于浓度,10uM浓度足以,抚养时间20-30分钟就足够了,避光,二硼化钙,37度。由于是活细胞检测,所以细胞状态很是重要,所以处理惩罚后要尽快检测,假如时隔断过长,大概会导致ROS增高,我一般最多一次做6个样,一次做多了,后头的样ROS就不怎么准了,做完后我会再把第一个转头再做一次,假如和开始检测时差不多,说明还可以。
关于阳性比较,H2O2 500uM常见,但并不是很好做,时间上要早,5分,10分钟的回响时间,再长大概就没了。尚有胰岛素(insulin),也在早期有ROS发生,这些比较做起来其实很难,时间一延误,就做不出来了。
至于ROS 过低,大概和细胞有关,细胞自己当地的ROS纷歧样,一般癌细胞的本底高,检测起来好出,有些细胞大概低了,我们尝试室做癌细胞还都能出来。还跟你的回响药物有关,大概真的没有ROS发生呢?这样的话,必需把阳性比较做出来才气说明模子正确。

关于活细胞检测,二硼化钙,有一点履历很简朴,但很有用,就是不要用PBS来当缓冲液,PBS身分太少,细胞很容易挂,我们用含糖的KRP,有人也用HANKS,这些都对细胞更好有些,就这些了,供参考。

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请问一下,我看到有说DCFH-DA需要用无酚红的造就基稀释,也有说用无血清的造就基,我的造就基是含酚红的,不知道行不可啊?有木有人知道 啊?

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