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应用PicoGreen荧光染料举办DNA准确定量

作者:互联网 发布时间:2017-04-12

        对微量的双链 DNA 举办定量在各类生物学应用中都显得很是重要,譬喻 cDNA 文库的构建;用于亚克隆的 DNA 片断的纯化;定量 DNA 扩增产品,在药物中DNA 分子残留的测定等 。检测核酸浓度最常用的要领就是检测核酸在 260nm ( A260 )处的光接收,这一要领主要的缺点是单链核苷酸和单核苷酸会发生滋扰信号,核酸样品中的杂质也会影响功效。光接收不能区分 DNA 和 RNA, 敏捷度也相对较低(用 1cm 的比色杯在 A260 值为 0.1 时相对应的双链 DNA 浓度为 5 μ g/ml )。
        Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料:其检测敏捷度高,可检测到pg级DNA;检测范畴宽,可超过4个数量级;特异性好,根基不受ssDNA和RNA的影响,而且可以耐受必然浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、卵白等滋扰。今朝利用Picogreen染料定量检测DNA已经遍及用于生物学检测,并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量要领。

道理:

检测要领:

2.所需器材
ModulusTM单管型多成果检测仪(9200-003)
微量适配器(9200-928)
微量比色皿
PicoGreen试剂
3. 试验方案
3.1 试剂筹备
        PicoGreen是以1mL的浓缩液形式生存在无水的 DMSO(二甲基亚砜)中。尝试当天,配制 2 × PicoGreen试剂的事情溶液,用 1×TE按 1:200的比例稀释浓缩液(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH7.5)。假如要筹备足够的事情溶液测定 20个样品,固体氨基甲酸钼,可在 20mL1x TE中插手 100μL PicoGreen dsDNA定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃外貌,要在塑料容器中配制。 PicoGreen试剂见光易降解,所以应将配好的溶液用箔包住或安排暗处避光生存。
溶液最亏得配制好数小时内利用,以担保最佳功效。
3.2 DNA尺度曲线
3.2.1尺度品事情液的配制:Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉(货号:D4522-1MG)1mg(Tris,Nacl等浓度已成尺度体系),插手1mL双蒸水,纳米二硫化钼,配制成1mg∕mL的尺度品事情液;
3.2.2尺度品事情液稀释:
(1)母液稀释:取10ul(1mg∕mL)尺度品事情液插手到990ul TE溶液中,浓度稀释成10ug∕mL,碳化钛铁,取10ul(10ug∕mL)尺度品事情液插手到990ul TE溶液中,纳米硫化钨,浓度稀释成100ng∕mL;
(2)倍比稀释:取800ul (100ng∕mL)的尺度品事情液插手到200ul TE溶液中,浓度到达80ng∕mL(药典划定:荧光染色要领DNA含量在1.25-80 ng/mL范畴线性较好, 该法DNA检出限为0.3 ng/ml),取500ul (80ng∕mL)的尺度品事情液插手到500ul TE溶液中,浓度稀释到40ng∕mL;依次倍比稀释,硫化锌,配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的尺度品溶液;

3.2.3尺度曲线的制备:倍比稀释后的各梯度尺度品溶液和染料事情液各取100ul混匀,避光室温安排5min。

3.2.4利用ModulusTM单管型多成果检测仪的Blue荧光模块检测样品的荧光值:将殽杂后的溶液插手微量比色皿,确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微量检测皿的外部,可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank,测定样品和空缺比较的荧光值;用尺度品溶液的浓度(ng/ml)对应的荧光强度作直线回归,制备尺度曲线

4 样品阐明
        在每个样品中插手等体积的 2×PicoGreen事情溶液( 3.1节筹备),充实混匀,避光于室温下孵育5分钟。将孵育好的溶液插手微量比色皿,利用ModulusTM单管型多成果检测仪检测其荧光值。将样品溶液的荧光强度代入回归方程,求出样品的残余DNA含量(ng/ml)。

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